Monitoramento de processo Raman de alto rendimento de purificação de proteína a jusante

A espectroscopia Raman é uma ferramenta comprovada para monitoramento e controle de processos em linha. Pode ser usado para quantifique as concentrações de compostos químicos online e em tempo real. Raman de alto desempenho espectroscopia, possibilitada pela fenda virtual de alto rendimento patenteada da Tornado Spectral Systems (HTVSTM), aumenta o sinal Raman aumentando o fluxo de fótons em 10x a 30x em comparação com espectrômetros convencionais. Este avanço significativo na tecnologia permite mais rapidez medições, limites inferiores de detecção e / ou o uso de potência do laser inferior intrinsecamente segura, quando necessário. Esses ganhos adicionais em qualidade espectral e sensibilidade permitem o sucesso em aplicações difíceis, como medições rápidas de proteínas de interesse durante o upstream e bioprocessamento downstream.
O processamento downstream refere-se à recuperação e purificação de produtos farmacêuticos biossintéticos de fontes biológicas, como um caldo de fermentação. De particular interesse é a produção e purificação de anticorpos monoclonais terapêuticos (mAb). Este mercado está projetado para atingir um valor de US $ 350 bilhões até o final de 2027. A parte posterior do processo normalmente é responsável por 50-80% dos custos de produção da terapêutica mAb (Farid, 2007; Gavara, Bibi, Sanchez, Grasselli,
& Fernandez ‐ Lahore, 2015) nos casos em que as plataformas de purificação de mAb envolvem pelo menos dois a três etapas cromatográficas e de filtração (Fahrner et al., 2001; Low, O’Leary, & Pujar, 2007).
Sensores de pH, condutividade, pressão, densidade óptica e espectroscopia UV de comprimento de onda único são amplamente implementado em processos de purificação cromatográfica. Os dados desses sensores são de utilidade limitada porque eles não podem fornecer informações moleculares detalhadas. A falta resultante de especificidade restringe a percepção do produto e caracterização e concentrações de impurezas. Alto A cromatografia líquida de desempenho (HPLC) é frequentemente usada para fornecer dados quantitativos complementares informações, mas um tempo significativo é necessário para obter os dados necessários e o atraso associado com esta modalidade de medição, portanto, geralmente não é suficiente para as necessidades do processo.
A espectroscopia Raman está emergindo como uma técnica para medições em tempo real para medições de processo a jusante. Raman pode quantificar vários produtos e impurezas simultaneamente com os tempos de medição levando segundos em vez de minutos. Conforme indicado acima, o analisador Raman da Tornado Spectral Systems HyperFluxTM PRO Plus (HFPP) oferece considerável melhoria na relação sinal-ruído (SNR) em comparação com espectrômetros Raman convencionais devido à sua tecnologia HTVSTM patenteada. O uso do HFPP como ferramenta de monitoramento resulta em mais rapidez e quantificação mais precisa de perfis de eluição de proteínas de processos de separação cromatográfica.
O aumento excepcional na taxa de transferência espectral devido aos resultados do HTVSTM em medições rápidas vezes juntamente com espectros de alta qualidade.

Isso permite a caracterização quantitativa e qualitativa de proteínas de interesse em tempo real. Isto por sua vez, fornece ao usuário informações acionáveis, o que facilita o controle preciso do processo. Dado que o processamento downstream é responsável por uma fração significativa dos custos de produção de proteínas, controle avançado neste estágio, tem potencial para gerar melhorias substanciais e desproporcionais na lucratividade.

Para destacar os benefícios da espectroscopia Raman de alto rendimento para purificação de proteínas a jusante, um sistema ÄKTATM Start foi conectado a um Tornado Spectral Systems HyperFluxTM PRO Plus Raman sistema. Para facilitar as medições de fluxo em linha, o HFPP foi equipado com uma célula de fluxo padrão configuração acoplada a uma sonda de imersão para medições Raman. Um diagrama de processo ilustrando a configuração da medição pode ser vista na Figura 1.
Parâmetros de coleta Raman – espectros Raman representativos foram coletados a cada 45 segundos (3000ms por exposição x 15 exposições médias por espectro). O UV integrado do sistema ÄKTATM Start detector (absorbância de 260 nm) foi usado para correlacionar os tempos de eluição com os dados do HFPP. Padrões de coluna e reagentes – O solvente de eluição para a coluna foi um tampão consistindo em 25 fosfato de sódio mM e NaCl 150 mM a um pH de 7,5. A HiPrepTM 16/60 SephacrylTM S-200 HR 120. Uma coluna de mL foi usada para separação por filtração em gel. Citocromo C liofilizado (CytC) (Sigma Aldrich) e BSA liofilizada (Sigma Aldrich) foram as proteínas utilizadas para esta experiência.
Preparação de amostras e filtração em gel – 25 mg de BSA e 12,5 mg de CytC foram dissolvidos em 5mL de fosfato de sódio 25 mM e tampão NaCl 150 mM. Antes da injeção da amostra, o sistema era preparado e equilibrado a 0,5 mL / min para um volume total de 1,2 volumes de coluna. A amostra CytC / BSA foi carregado em um loop de amostra de 2 mL e injetado na coluna a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min. A eluição completa de BSA e CytC ocorreu após 95 mL de eluição.

A Figura 3 mostra os gráficos de correlação para o modelo construído usando as amostras de calibração. A excelente concordância entre a previsão do modelo e os valores de referência demonstra que o monitoramento em linha pode ser realizado com alta precisão e cadência de medição rápida.

Para prever as concentrações de CytC e BSA durante a eluição, um modelo de calibração quantitativa foi desenvolvido usando preparações separadas de CytC e BSA em concentrações que variam de 0,25 mg / mL a 4,5 mg / mL. A Figura 2 mostra os espectros para BSA, CytC e tampão. A principal região espectral de interesse variou de 900 cm-1 a 1500 cm-1, que é destacado no detalhe da Figura 2. A Parcial pelo menos o modelo quantitativo de quadrados (PLS) foi construído com o software de análise PEAXACT (S-Pact GmbH). Os espectros foram pré-tratados com uma subtração de elástico, suavização de 19 pt e normalização SNV. Com base nos atributos estatísticos do modelo, a concentração de proteína foi determinada com um erro de 0,109 mg / mL e 0,070 mg / mL para BSA e CytC, respectivamente.Tornado pode ser multiplexado para uso com até 8 canais.

A Figura 4 exibe os espectros pré-tratados coletados durante o processo de filtração em gel. Eluição BSA picos podem ser vistos em torno de 50 mL, enquanto os picos de eluição CytC ocorreram em torno de 82 mL. Estrutural mudanças nos espectros eram visíveis entre 50 mL (verde) e 82 mL (azul).
A Figura 5 mostra os resultados do modelo PLS aplicado aos espectros coletados da filtração em gel eluição. Isso permitiu que as concentrações de proteínas individuais fossem acompanhadas em tempo real. O perfil de concentração versus volume está bem correlacionado com o cromatograma baseado em UV. O modelo também tem um bom grau de especificidade preditiva, uma vez que concentrações próximas de zero de BSA são previstas durante a eluição CytC e vice-versa. Com base na área sob a curva, podemos estimar o total quantidade de eluição da proteína. A massa nominal injetada de BSA foi de 10 mg e o Raman previsto a massa total de BSA era de 9,28 mg. A massa nominal injetada de CytC foi de 5 mg e o Raman a massa total prevista de CytC era 4,45 mg. Isso sugere recuperações de 93% e 89%, respectivamente.

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Fahrner, R. L., Knudsen, H. L., Basey, C. D., Galan, W., Feuerhelm, D., Vanderlaan, M., & Blank, G. S. (2001). Industrial purification of pharmaceutical antibodies: Development, operation, and validation of chromatography processes. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 18(1), 301–327. Gavara, P., Bibi, N., Sanchez, M., Grasselli, M., & Fernandez-Lahore, M. (2015). Chromatographic Characterization and Process Performance of Column-Packed Anion Exchange Fibrous Adsorbents for

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Monoclonal antibody THERAPY market Size, share & amp; industry analysis, by TYPE (Human monoclonal Antibody, humanized monoclonal Antibody, chimeric monoclonal antibody, AND Murine Monoclonal ANTIBODY), by Application (CANCER, autoimmune diseases, and others), by distribution Channel (Hospital Pharmacy retail pharmacy, and Online PHARMACY), and Regional Forecast, 2020-2027. (2020, May). Retrieved from https://www.fortunebusinessinsights.com/monoclonal-antibody-therapy-market-102734

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