Ruptura de alta produtividade de levedura em um formato de 96 poços

A riqueza de informações geradas a partir de anos de análises bioquímicas, genéticas e moleculares fez das leveduras modelos de sistemas biológicos e ferramentas para cientistas biofarmacêuticos.
Consequentemente, a levedura é um hospedeiro popular para estudos de expressão gênica e para a produção de proteínas recombinantes. Embora muitas espécies de levedura estejam em uso, incluindo Pichia, Hansenula e Debaryomyces, a levedura mais popular continua a ser Saccharomyces. O mRNA de levedura e as proteínas intracelulares costumam ser difíceis de extrair intactas das células por métodos enzimáticos tradicionais. As enzimas de lise são frequentemente preparações brutas contendo RNases e proteases que não atacam apenas a parede celular, mas também as moléculas de interesse. Além disso, os protoplastos gerados a partir da digestão enzimática geralmente requerem lise com detergentes que também desnaturam muitas proteínas até a inatividade. Portanto, a quebra / fratura mecânica da célula de levedura é freqüentemente necessária para liberar as moléculas.

A ruptura mecânica de leveduras tem sido tradicionalmente realizada usando uma prensa ou moinho de esferas (ou seja, batedor de esferas). Em ambas as abordagens, as amostras são processadas individualmente. Para experimentos em que um grande número de clones de levedura deve ser examinado em um ambiente de triagem de alto rendimento, o processamento individual é um grande gargalo e impraticável. Consequentemente, é necessário um método que combine a interrupção mecânica das células em um formato de alto rendimento. O Geno / Grinder (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ), um moinho de esferas originalmente projetado para esmagar sementes em placas de poços profundos, pode ser usado para romper a levedura em um formato de placa de micropoços.

Figura 1. Levedura de controle negativo sem grânulos de vidro.
A levedura permaneceu intacta após o processamento por 10 min. no Geno / Grinder.

Figura 1. Levedura de controle negativo sem grânulos de vidro. A levedura permaneceu intacta após o processamento por 10 min. no Geno / Grinder.

Figura 2. Levedura interrompida por 5 min. com contas de vidro de malha 425-600. A levedura rachada aparece como “fantasmas” escuros, enquanto a levedura intacta continua a refratar a luz e parece brilhante.

Saccharomyces cerevisiae foi cultivada durante a noite em meio YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose) a 30 ° C com agitação (150 rpm). Usando uma placa de microtitulação de 96 poços estéril (Corning Life Science Products), 100 μl de caldo de cultura foram adicionados a cada poço junto com 50 mg de contas de vidro lavadas com ácido (Sigma, G-8772). Uma gama de tamanhos de contas de vidro foi usada incluindo 106 mesh (muito pequeno), 150-212 mesh, 212-300 mesh e 425-600 mesh (grande). O caldo de cultura sem contas de vidro também foi preparado como controle negativo. A placa foi selada com um tapete de vedação de borracha e travada no Geno / Moedor. As células de levedura foram rompidas por 5 e 10 minutos a 1500 rpm. Após a interrupção, as culturas de levedura foram examinadas por microscopia de contraste de fase e fotografadas.

A eficiência da ruptura da levedura depende do tamanho das contas de vidro e da duração da trituração. As Figuras 1-3 demonstram a eficiência da ruptura celular com contas de vidro de malha 425-600 em 5 e 10 minutos. As contas de vidro de malha inferior foram menos eficazes no craqueamento de células, sendo as contas de malha 106 particularmente ineficazes. Conclui-se que as contas de vidro de malha 425-600 são as mais adequadas para romper Saccharomyces. O design do Geno / Grinder também é considerado um fator no processo de interrupção. Moinhos de contas padrão adaptados a placas de micropoços são modelados a partir de “agitadores de tinta” e movem as placas em um movimento de “oito”. Acredita-se que esse movimento não leve a uma ruptura uniforme das células. O Geno / Grinder é projetado para interromper com eficácia os materiais celulares, oscilando a placa verticalmente.

Figura 3. Levedura interrompida por 10 min. com contas de vidro de malha 425-600. A maioria das leveduras foi efetivamente destruída, conforme demonstrado por fantasmas celulares e fragmentos celulares. Algum fermento intacto permanece.