Extração de RNA / cDNA e DNA genômico de tecido com PCR em tempo real

Amostras frescas de tecido animal foram coletadas, cortadas para aproximadamente 50 -100 mg de peso úmido, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80oC. Os animais eram humanos, cães, gatos, ratos, vacas e cavalos, bem como peixes e mariscos; consulte a Tabela 1. Antes da extração de DNA e / ou RNA, os tecidos foram transferidos congelados para uma placa de titulação de poço profundo sobre um bloco de gelo seco. Cada poço continha duas bolas de aço inoxidável de 4 mm (SPEX SamplePrep nº cat. 2150) e 500 microlitros de tampão (tampão de lise de purificação de ácido nucleico Applied Biosystems). As placas foram seladas com uma tampa de plástico e submetidas a trituração no Geno / Grinder por 2 minutos em um ajuste de 1000 golpes por minuto. Após 30 minutos a 4oC, os lisados ​ foram usados ​​para extração de gDNA ou extração de RNA total. As condições foram otimizadas para uma estação de trabalho automatizada de ácido nucleico (ANA) Applied Biosystems 6700, de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade final de tecido submetido a extrações de RNA e / ou DNA ficou entre 10 e 20 mg.

Para avaliar a qualidade do RNA extraído, DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando produtos Invitrogen: 200 unidades de SuperScript III, 600 ng de hexadeoxirribonucleotídeo aleatório (pd (N) 6) primer (priner hexâmetro aleatório), 10 U RnaseOut (Rnase inibidor) e dNTPs 1 mM em um volume final de 40 µL. A reação de transcrição reversa ocorreu por 50 minutos a 50ºC. Após adição de 60 µL de água, a reação foi terminada por aquecimento por 5 minutos a 95ºC e resfriamento em gelo. A qualidade do cDNA é avaliada de acordo com o valor CT obtido com um sistema de PCR TaqMan de controle endógeno de uma quantidade definida de tecido. As amostras com valores acima de um certo limite indicam qualidade da amostra prejudicada e degradação do RNA total e garantem a reextração de uma amostra de backup para avaliar a qualidade do cDNA.

Para avaliar a qualidade do RNA extraído, DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando produtos Invitrogen: 200 unidades de SuperScript III, 600 ng de hexadeoxirribonucleotídeo aleatório (pd (N) 6) primer (priner hexâmetro aleatório), 10 U RnaseOut (Rnase inibidor) e dNTPs 1 mM em um volume final de 40 µL. A reação de transcrição reversa ocorreu por 50 minutos a 50ºC. Após adição de 60 µL de água, a reação foi terminada por aquecimento por 5 minutos a 95ºC e resfriamento em gelo. A qualidade do cDNA é avaliada de acordo com o valor CT obtido com um sistema de PCR TaqMan de controle endógeno de uma quantidade definida de tecido. As amostras com valores acima de um certo limite indicam qualidade da amostra prejudicada e degradação do RNA total e garantem a reextração de uma amostra de backup. Para avaliar a qualidade do cDNA

Para avaliar a qualidade do DNA genômico extraído, sistemas específicos de TaqMan PCR foram desenvolvidos visando genes de cópia única para permitir a quantificação de equivalentes de genoma e números de células. Uma visão geral dos sistemas TaqMan usados ​​para o controle de qualidade do gDNA é fornecida na Tabela 1. A qualidade do gDNA de uma quantidade definida de tecido é avaliada de acordo com o valor CT usando um sistema TaqMan PCR direcionado a um gene de cópia única. As amostras com valores acima de um certo limite indicam DNA degradado e garantem a reextração de uma amostra de backup. Os sistemas GAPDH TaqMan podem ser usados ​​para direcionar o pseudogene GAPDH de cópia única (Galland et al., 1990; Garcia-Meunier et al., 1993).

Cada reação TaqMan PCR em tempo real continha 400 nM de cada iniciador, 80 nM da sonda TaqMan e mastermix PCR disponível comercialmente (TaqMan Universal PCR Mastermix, Applied Biosystems) contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 5 MgCl2 mM, trifosfatos de desoxinucleotídeo 2,5 mM, 0,625 U AmpliTaq Gold DNA polimerase por reação, 0,25 U AmpErase UNG por reação e 5 µL da amostra de cDNA diluída ou o gDNA em um volume final de 25 µL. As amostras foram colocadas em placas de 96 poços e amplificadas em um fluorômetro automatizado (ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems). As condições de amplificação foram 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C e 60 s a 60 ° C.

Pseudogenes GAPDH:

Galland, F., M. Stefanova, V. Pirisi e D. Birnbaum. 1990. Characterization of a murine glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase pseudogene. Biochimie. 72: 759-62.

Garcia-Meunier, P., M. Etienne-Julan, P. Fort, M. Piechaczyk e F. Bonhomme. 1993. Evolução concertada na família GAPDH de pseudogenes retrotranspostos. Mamm. Genome. 4: 695-703. Leutenegger, CM, B. von Rechenberg, K. Zlinsky, C. Mislin, M. Akens, J. Auer e H. Lutz:

PCR quantitativo em tempo real para mRNA de citocinas equinas em tecido ósseo não descalcificado incorporado em metacrilato de metila. Calcified Tissue International, 65: 378-383, 1999.

Leutenegger, CM, AM Alluwaimi, W. Smith, L. Perani, JM Cullor. Quantificação de mRNA de citocinas bovinas em células de leite de bovinos saudáveis ​​por reação em cadeia da polimerase TaqMan em tempo real. Imunologia e Imunopatologia Veterinária. 77: 275-287, 2001.

Leutenegger, CM. O TaqMan PCR em tempo real e aplicações em Medicina Veterinária. Veterinary Sciences Tomorrow, Online Journal, 1 de janeiro de 2001.