Extração de ácidos nucleicos de folhas de beterraba sacarina

No âmbito de um projeto TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes), os ácidos nucleicos do material da folha devem ser isolados de potenciais mutantes. Primeiro, uma variedade representativa de mutantes EMS (etil metano sulfonato) é produzida a partir de 2.000 a 5.000 plantas M2 e identificada através do TILLING. A tecnologia TILLING é um método novo e muito eficaz de genética reversa para a produção e identificação de perda / ganho de mutações de função de genes comercialmente valiosos sem modificação genética. Para estabelecer uma plataforma TILLING com extração automatizada de DNA e amplificação por PCR de genes alvo, é necessária a extração de ácido nucleico de rendimento consistente e de boa qualidade. A detecção eficaz da mutação pontual ocorre por meio da formação de heterodúplex entre as moléculas de DNA do tipo selvagem e mutante.

Durante o primeiro ano do projeto, o DNA de 2.688 plantas individuais foi isolado usando um kit de placa de microtitulação de 96 poços. (NucleoSpin Multi-96 Plant, Machery & Nagel, Düren). O tecido da planta (0,5 -1 g) foi liofilizado em um recipiente Eppendorf de 2ml e, em seguida, moído no Geno / Grinder com duas bolas de metal em uma configuração de 1000 (1000 golpes min-1) por 2 x 1 minuto. Para isso, quatro montagens (blocos de plástico) foram produzidos internamente, cada um contendo 24 recipientes Eppendorf, e fixados no Geno / Grinder. Este tipo de amostragem permite uma configuração flexível das amostras individuais. Depois de moer o tecido em um pó fino, as amostras foram carregadas com 300 μl de tampão C1 e homogeneizadas no Geno / Moedor por 30 segundos em uma configuração de 1000 (1000 golpes min-1). Após a lise, as amostras centrifugadas são transferidas para placas de microtitulação (poços redondos). Após mistura, filtração, várias etapas de enxágue e secagem, as amostras são finalmente eluídas. A quantificação do DNA é realizada por fotometria e eletroforese em gel. Posteriormente, as amostras podem ser armazenadas por longo prazo a -20 ° C.

Aproximadamente 40% das amostras produziram entre 100 e 1500 ng de DNA. Apenas 2% das amostras não produziram uma quantidade adequada de DNA. Os rendimentos máximos ficaram em torno de 16 μg. Para um PCR de rotina, 1 ng de DNA puro é usado. Uma redução adicional da quantidade de DNA é possível. A seleção da população mutante é realizada com pools de DNA. Com uma composição de pool de 8 amostras diferentes, a quantidade de DNA utilizada é reduzida para 0,125 ng / planta individual de modo que, com 100 ng de DNA, a seleção de pools de DNA com 800 sequências alvo diferentes se torna possível. A reprodução in vitro de DNA linear com GenomiPhi (GE Healthcare) permite análises adicionais de DNA com tamanhos de amostra pequenos.

A homogeneização de folhas de beterraba sacarina com o objetivo de extrair e isolar DNA para subsequente amplificação por PCR requer uma quantidade suficiente de produção de ácido nucleico de boa qualidade (> 1ng). Com um processo básico de moagem de 2 x 1 minuto de material de folha seca e subsequente homogeneização úmida de 30 segundos, apenas 2% de mais de 2600 não produziram material de DNA adequado. Isso demonstra a excelente adequação do Geno / Grinder para processamento de alto rendimento de folha de beterraba sacarina.