Extração de ácido perclórico de folhas para medição de amido e metabólitos solúveis

O material vegetal colhido (até cerca de 300 mg) é pré-pesado em frascos de policarbonato de 5 ml (SPEX SamplePrep nº cat. 2240-PC) adequados para uso no instrumento Geno / Grinder®. Os tubos são então tampados e colocados imediatamente em nitrogênio líquido (o tempo entre a colheita e o congelamento deve ser o mais curto possível) NB: O material vegetal pode ser colhido e congelado em qualquer frasco criogênico e, em seguida, transferido para os tubos Geno / Grinder pouco antes moagem se necessário. Em seguida, transfira os tubos para gelo seco para manter o material congelado e adicione 500 μl de ácido perclórico 0,7 M gelado a cada tubo. Deixe o ácido congelar. Coloque uma bola de aço inoxidável de boa qualidade, com 10 mm de diâmetro em material de grau 316, em cada frasco. Tampe os tubos com segurança e coloque-os no suporte de espuma do moedor.

Coloque e fixe o suporte contendo os tubos na máquina de acordo com as instruções do Geno / Moedor. Moa as amostras por 90 segundos a 1500 golpes por minuto ou até que a amostra seja pulverizada suavemente. Transfira os tubos para o gelo imediatamente após a trituração. Adicione 2500 μl adicionais de ácido perclórico 0,7 M gelado a cada tubo e vortex brevemente. Centrifugue por 10 min a 4º C e 14.000 xG.

Remover e neutralizar o sobrenadante resultante a pH 6-7 por adição de 2 M KOH, 0,4 M MES, 0,4 M KCl. Após centrifugação para remover o perclorato insolúvel, a solução neutralizada pode ser usada para ensaio de metabólitos solúveis. Todas as etapas devem ser realizadas a 0-4 ºC. O pellet contém o amido. Após lavagem com água para remoção do ácido perclórico, pode ser utilizado para dosagem do amido segundo Smith e Zeeman (2006).