Efeito do tempo de lise e outras variáveis ​​na extração de DNA de manjericão fresco lisado em tubos de 2 ml com o Geno / Grinder®

Os lisadores de células mecânicos são usados ​​para a extração eficaz de DNA genômico de amostras contendo tecido vegetal ou animal. No entanto, todos os lisadores mecânicos não fornecem o mesmo resultado. O Geno / Grinder® foi comparado com um lisador de células competitivo (Competidor A) para extração de DNA de manjericão fresco. Além disso, o tempo de homogeneização e a taxa de operação foram variados para o Geno / Moedor, enquanto os tampões, meios de moagem e tamanho do tubo permaneceram constantes. Os resultados indicaram que o uso do Geno / Grinder proporcionou DNA com peso molecular maior do que o instrumento competitivo. Além disso, as condições de homogeneização ideais usando o Geno / Grinder foram encontradas em 90 segundos. a uma taxa de 2.000 ciclos / min.

Três matrizes de frutas e vegetais foram escolhidas com o objetivo de avaliar materiais com diferentes densidades e tenacidade: 1) morango – macio; 2) maçãs – densas e duras; e 3) aipo – fibroso. Os morangos são muito macios e testes preliminares verificaram que eles poderiam ser facilmente moídos até uma substância mole e liquefeita usando o Geno / Moedor (método de moagem descrito abaixo). As maçãs são mais duras e densas e, não surpreendentemente, um tempo de moagem mais longo foi necessário para triturar efetivamente a fruta até a consistência de compota de maçã. Embora o aipo não seja tão denso quanto a maçã, ele é fibroso e duro e, portanto, difícil de moer com eficácia.

:: Tubos: tubos com tampa de rosca de fundo cônico de 2 ml em um suporte padrão de 48 poços.

:: Meios de moagem: Granada e esfera de cerâmica única de 1/4 de polegada (“Matriz de Lise A”).

:: Amostra: 100 mg de folha de manjericão fresca, colhida de planta viva imediatamente antes da lise. > 1 grama de folhas foram cortadas em pequenos pedaços e misturadas. 100 mg de mistura de folhas cortadas foram colocados em cada um dos 10 tubos.

:: Reagentes de Lise: 400 ml de tampão Ap1 e 4 ml de RNaseA do kit de isolamento de DNA genômico disponível comercialmente foram adicionados a cada tubo.

:: Homogenização:

Marcador externo (pistas 1 e 14): escada Kb
Marcador interno (pistas 2 e 13): Lambda Hind III

A purificação pós-lise foi realizada usando um kit de planta disponível comercialmente de acordo com o manual do kit.

Após homogeneização por 40 seg. usando o lisador de células competitivo, DNA de peso molecular inferior (qualidade inferior) foi obtido do que para amostras processadas em qualquer um dos quatro tempos de execução usando o Geno / Grinder. Aos 90 e 120 segundos, quase todo o DNA isolado usando o Geno / Grinder era superior a 6.557 pb, indicando que cisalhamento ou degradação significativa não ocorreu, mesmo no tempo de processamento mais longo. Pouca ou nenhuma diferença nos resultados foi observada nesses dois tempos de processamento. Enquanto os tempos de execução são de 40 e 60 seg. no Geno / Grinder produziu DNA de alto peso molecular, quantidades insuficientes foram obtidas.

As melhores condições para o processamento do manjericão fresco foram encontradas em 90 seg. a 2.000 ciclos / min com o 2.000 Geno / Grinder. Aumentando o tempo de processamento para 120 seg. não parecia oferecer qualquer benefício. Além disso, o uso do Geno / Grinder deu DNA de maior qualidade do que o obtido com o lisador competitivo. Otimização adicional do tempo de processamento pode ser possível, variando o tipo e tamanho do meio de moagem. No entanto, isso estava além do escopo deste projeto e não foi tentado. As condições ideais de lise para o 2010 Geno / Grinder redesenhado podem diferir um pouco daquelas relatadas aqui.