Análise de pesticidas em frutas e vegetais usando um método QuEChERS padrão e um método modificado envolvendo o Geno / Moedor

Resíduos de pesticidas em fontes de alimentos agrícolas são amplamente considerados como causadores de efeitos adversos à saúde quando consumidos por humanos. Em particular, muitos dos produtos vendidos nos Estados Unidos são importados e a preocupação com os níveis de pesticidas nessas frutas e vegetais em comparação com aqueles cultivados no mercado interno resultou no aumento dos testes para resíduos de pesticidas.

Em 2003, o método QuEChERS para análise de pesticidas foi introduzido por Anastassiades e Lehotay et al. QuEChERS é um acrônimo para Rápido, Fácil, Barato, Eficaz, Robusto e Seguro e permite a análise de vários pesticidas, enquanto oferece um manuseio mais rápido e fácil em relação aos métodos anteriores. O método QuEChERS é agora amplamente utilizado e foi adotado pela AOAC como método 2007.01 “Determinação de resíduos de pesticidas em alimentos por extração e partição de acetonitrila com sulfato de magnésio”. Na Europa, o método oficial é EN 15662.

Para uma análise típica, amostras de 10 -15 g de produtos agrícolas picados e homogeneizados são colocadas em tubos de centrífuga de 50 ml e um solvente de extração, tal como acetonitrila, sulfato de magnésio anidro e acetato de sódio ou sais de cloreto de sódio são adicionados. Os tubos são tampados e agitados manualmente por um minuto para misturar o conteúdo e extrair o pesticida no solvente. As amostras são então tratadas com materiais de limpeza, concentradas e analisadas por GC / MS ou LC / MS.

Neste estudo, o Geno / Grinder foi empregado para homogeneizar as amostras de frutas / vegetais e misturar os produtos de forma rápida e completa com os sais e o solvente em um esforço para melhorar a etapa de extração. O objetivo do estudo era determinar se o uso do Geno / Grinder durante a etapa de extração aumentaria a recuperação de pesticidas em relação ao método QuEChERS manual tradicional.

Três matrizes de frutas e vegetais foram escolhidas com o objetivo de avaliar materiais com diferentes densidades e tenacidade: 1) morango – macio; 2) maçãs – densas e duras; e 3) aipo – fibroso. Os morangos são muito macios e testes preliminares verificaram que eles poderiam ser facilmente moídos até uma substância mole e liquefeita usando o Geno / Moedor (método de moagem descrito abaixo). As maçãs são mais duras e densas e, não surpreendentemente, um tempo de moagem mais longo foi necessário para triturar efetivamente a fruta até a consistência de compota de maçã. Embora o aipo não seja tão denso quanto a maçã, ele é fibroso e duro e, portanto, difícil de moer com eficácia.

Morangos frescos, maçãs (Granny Smith) e aipo foram comprados em um supermercado local e cortados em pedaços de 1/4 a 1/2 polegada, pesados ​​em quantidades de 15,1 g e colocados em tubos de centrífuga de LDPE de fundo redondo de 50 ml. Cada amostra foi enriquecida com 250 µl de uma solução de 40 µg / ml de CAL-CARB-13 (uma mistura de 13 pesticidas comuns disponíveis na SPEX CertiPrep) em diclorometano (10 ppm por amostra). A mistura de pesticidas foi introduzida em cada tubo por meio de seringa, tendo o cuidado de controlar o fluxo da solução de pesticidas na amostra de frutas / vegetais. Os tubos foram tapados e agitados suavemente à mão durante 15 seg. para garantir uma distribuição uniforme da solução de pesticida em toda a amostra. As amostras foram colocadas em um refrigerador a 4 ° C e armazenadas durante a noite.

As amostras de morango enriquecidas de quatro tubos de centrífuga (cada um contendo 15,1 g) foram transferidas coletivamente para um misturador de dose única e homogeneizadas até uma consistência macia. Amostras de 15,1 g foram medidas novamente a partir desta mistura e transferidas de volta para os mesmos tubos de centrífuga. Foi tomado cuidado para transferir o líquido e também o material sólido. Amostras de maçã e aipo foram enriquecidas e homogeneizadas da mesma maneira que o morango.

A cada tubo de produto homogeneizado foi adicionado 6,0 g de sulfato de magnésio anidro, 1,5 g de acetato de sódio anidro e 15 mL de acetonitrila contendo 1% de ácido acético glacial. Os tubos foram tapados e agitados manualmente durante 1 min. Observou-se que o líquido nos tubos de morango tinha uma cor rosa, o extrato de maçã era amarelo claro e o extrato de aipo tinha uma cor verde muito saturada.

Todos os tubos foram centrifugados a 3500 rpm por 3 min. O líquido sobrenadante foi removido, medido e dividido em duas porções iguais (máximo de 5 ppm de pesticida por amostra após esta etapa) e transferido para tubos de centrífuga de 15 ml.

A amina secundária primária (PSA) {25 mg x Vol (ml) sobrenadante} e negro de fumo grafitado (GCB) {5 mg x Vol (ml) sobrenadante} foram adicionados a cada tubo. Os tubos de amostra foram tampados e agitados manualmente por 30 segundos, depois centrifugados a 3200 rpm por 1 minuto.

Para os tubos de centrifugação contendo amostras de produtos enriquecidos foram adicionados 3 cilindros de trituração de cerâmica (3/8 “x 7/8” peça de corte angular # 2183) e 5 ml de acetonitrila contendo 1% de ácido acético glacial. Os tubos foram tampados e colocados em um porta-tubos, fixados no Geno / Grinder e moídos a 1.500 rpm. Após trituração por 2 min., as amostras de morango foram bem moídas até uma consistência líquida e polpuda. Como maçã e aipo são materiais mais resistentes, 6 min. em tempos de moagem a 1500 rpm eram necessários para atingir uma consistência bem moída e pastosa.
Durante os testes preliminares, verificou-se que a adição de uma pequena quantidade (5 ml) de solvente melhorou o processo de moagem, auxiliando na movimentação do produto no tubo. Sem solvente, as frutas e vegetais mais duros tendiam a se acumular no fundo do tubo e a trituração eficaz era difícil de conseguir. Alternativamente, a adição de 15 ml completos de solvente antes da moagem proporcionou muito fluido e os meios de moagem não foram capazes de fazer contato suficiente com o produto para obter uma moagem eficaz. Por meio de experimentação, foi determinado que a adição de 5 ml de solvente era ótima para a trituração eficaz de uma amostra de 15 g.

A cada tubo foram então adicionados 6 g de sulfato de magnésio anidro, 1,5 g de acetato de sódio anidro e os restantes 10 ml de acetonitrilo (ácido acético glacial a 1%). Os tubos foram tapados novamente, colocados de volta no Geno / Grinder e agitados durante 1 min. a 1500 rpm. O líquido nos tubos de morango: observou-se que o líquido era de cor rosa, o extrato de maçã era amarelo claro e o extrato de aipo tinha uma cor verde muito saturada. Todo o material foi bem misturado e fluiu livremente.
As amostras foram então centrifugadas a 3500 rpm por 3 min. O líquido sobrenadante foi removido de cada tubo, medido e dividido em duas amostras iguais (5 ppm máx. de pesticida após esta etapa) e transferido para 15 tubos de centrífuga.
PSA (25 mg x Vol (ml) sobrenadante) e GCB (5 mg x Vol (ml) sobrenadante) foram adicionados a cada tubo. Os tubos de amostra foram tampados, agitados no Geno / Grinder por 30 seg. a 1500 rpm, depois centrifugado a 3200 rpm por 1 min.

Amostras adicionais de morango enriquecido foram manipuladas de uma segunda maneira. Em um esforço para determinar se a etapa de pré-homogeneização pode ser eliminada para frutas moles, 6 g de sulfato de magnésio anidro, 1,5 g de acetato de sódio anidro e 15 ml de acetonitrila (1% de ácido acético glacial) foram adicionados a tubos contendo 15,1 g de morango. Os tubos foram tampados e fixados no Geno / Grinder.
Após 2 min. de moagem a 1500 rpm, o morango estava razoavelmente bem triturado, mas alguns pedaços visíveis permaneceram. As amostras foram moídas por mais 2 min. (4 min. Total), momento em que o morango estava muito bem moído e bem misturado com os sais e o solvente. As amostras foram centrifugadas, o sobrenadante removido e a limpeza foi conduzida como acima, usando o Geno / Moedor.

As tentativas de combinar as etapas de homogeneização e extração para maçã e aipo tiveram menos sucesso. Quando os sais foram combinados com pequenos pedaços de produtos, um tubo foi enchido até a capacidade máxima e os produtos e meios de moagem não puderam se mover livremente. Assim, o impacto da mídia de moagem no produto foi impedido e apenas uma moagem parcial foi alcançada.

Após a limpeza e centrifugação, o sobrenadante foi removido de cada amostra, transferido para um tubo limpo de 15 ml (todos os métodos) e concentrado até quase a secura (aproximadamente 100 µL), aquecendo suavemente os tubos enquanto passa um fluxo lento de nitrogênio sobre a amostra. Tolueno foi adicionado a cada amostra para trazer o volume total da amostra para 1 ml. Em muitos casos, uma gota viscosa de material depositou-se no fundo do tubo de centrífuga após a adição de tolueno. O material parecia ser solúvel em solventes aquosos, mas não em solventes apolares e tinha uma consistência xaroposa.
A solução de tolueno foi removida por seringa e injetada em frascos de amostra de GC, enquanto o material residual foi deixado no tubo. No caso do morango, o resíduo era vermelho nas amostras preparadas com Geno / Grinder e amarelo nas amostras preparadas no método QuEChERS padrão. No caso da maçã, o resíduo era dourado para as amostras Geno / Moedor e marrom para as amostras QuEChERS padrão. Para o aipo, um resíduo amarelo permaneceu para as amostras Geno / Moedor, enquanto para as amostras QuEChERS padrão foi observada uma gota amarelo pálido.

Análise de Amostra

As amostras foram analisadas usando um HP 5890-GC com uma coluna capilar CV-5 e um detector 5972-MSD. A faixa de varredura foi de 35-450 m / z com sinal-ruído de 3: 1. O tamanho da amostra injetada foi de 1 µl.

No início do estudo, cada amostra foi enriquecida com 250 µl de uma solução de 13 pesticidas, cada um presente na concentração de 40 ppm / ml. Assim, 10 ppm de cada pesticida foram introduzidos em cada amostra de produto. Após extração e centrifugação, o sobrenadante foi removido e dividido em duas réplicas iguais para continuar o estudo. Portanto, cada amostra foi dividida em duas e a concentração máxima de cada pesticida em uma amostra neste momento era de 5 ppm.
Os resultados de recuperação para todas as três matrizes de produtos são mostrados na Tabela 1 como concentração total recuperada em ppm. Os resultados para morango são mostrados graficamente na Figura 1. As barras azuis representam as amostras que foram preparadas agitando manualmente as amostras homogeneizadas com os sais e acetonitrila. As barras vermelhas representam as amostras que foram homogeneizadas usando o Geno / Moedor antes da adição dos sais. Finalmente, as barras verdes (All in one) mostram os resultados para as amostras que foram moídas e misturadas com os sais e acetonitrila simultaneamente (sem pré-homogeneização).

Para todos os pesticidas detectados, recuperações significativamente maiores foram obtidas para as amostras preparadas usando o Geno / Moedor do que para aquelas preparadas manualmente. Curiosamente, as amostras moídas simultaneamente com os sais e o solvente (all in one) tiveram um desempenho tão bom ou em alguns casos melhor do que as amostras que foram moídas no Geno / Moedor, antes da adição dos sais. Isso indica que esse método é viável para matrizes de produtos leves.
As recuperações mais pobres foram obtidas para Diclorano e Corotalonil. Esse foi o caso para todas as matrizes avaliadas. Na verdade, para o aipo não foi detectado clorotalonil, mesmo quando o Geno / Moedor foi usado. Como o método usado neste estudo não foi otimizado para um tipo específico de pesticida, não é surpreendente que alguns pesticidas não fossem estáveis ​​nas condições usadas.

A Figura 2 mostra os resultados de recuperação para a maçã. Novamente, o método Geno / Grinder superou o método manual padrão. Maiores recuperações foram obtidas para todos os pesticidas detectados quando o Geno / Moedor foi usado para moer a maçã e misturar a massa polpuda resultante com os sais e acetonitrila, com exceção do Azinfos-Metila onde a recuperação para os dois métodos foi semelhante. Para a maioria dos pesticidas, as recuperações foram semelhantes às obtidas nas amostras de morango. No entanto, os resultados da Difenilamina das amostras de Geno / Moedor deram uma recuperação de 6,2 ppm, que é maior do que os 5 ppm que foram introduzidos na amostra. A recuperação desse pesticida pelo método manual (3,8 ppm) também foi maior do que para os demais pesticidas nessas mesmas amostras. A difenilamina é comumente usada na proteção de cultivos para maçãs e a alta concentração desse pesticida é provavelmente o resultado de sua presença na maçã antes da adição do pico do pesticida. No entanto, os resultados para as amostras Geno / Grinder foram significativamente maiores do que para a amostra QuEChERS padrão.

Os resultados para o aipo são mostrados na Figura 3. Assim como com morango e maçã, as recuperações para as amostras Geno / Moedor são muito maiores do que para as amostras preparadas manualmente. Para todas as três matrizes avaliadas, o Geno / Grinder extraiu alguns pesticidas que não foram detectados nas amostras preparadas manualmente. Particularmente notável no caso do aipo é Vinclozolin; a recuperação está no mesmo nível que Metalxyl e Systhane para amostras preparadas usando o Geno / Grinder, mas foi completamente não detectada nas amostras QuCEhERS padrão.

É claro a partir dos gráficos anteriores que o uso do Geno / Moedor aumentou significativamente a recuperação de pesticidas neste estudo. Uma vez que o Geno / Grinder agita as amostras com muito mais vigor e rapidez do que pode ser feito manualmente, não é surpreendente que a extração tenha sido mais eficaz. Durante uma corrida de 1 minuto em uma configuração de 1500 rpm, o Geno / Grinder balança um tubo em um ciclo completo de subida e descida 1500 vezes, enquanto um ser humano pode agitar um tubo cerca de 200 vezes em 1 minuto. Além disso, os tubos de amostra executados no Geno / Moedor continham, cada um, 3 cilindros de moagem de cerâmica com corte angular. Estes auxiliam na mistura completa da amostra com o solvente e sais, mas também moem o produto, garantindo uma extração completa do pesticida.
Assim, para matrizes de produtos moles, pode ser possível eliminar a etapa de pré-homogeneização, reduzindo ainda mais o tempo de preparação da amostra.
Além de melhorar a recuperação de pesticidas, o uso do Geno / Grinder aumenta o rendimento, pois um maior número de amostras pode ser homogeneizado e extraído de uma só vez. Neste estudo, doze tubos de 50 ml foram agitados simultaneamente no Geno / Grinder, enquanto um máximo de quatro tubos foram agitados manualmente de uma vez. Durante a etapa de limpeza, o Geno / Grinder acomodou vinte e quatro tubos de 15 ml, enquanto um máximo de seis foram agitados manualmente.

Foram avaliadas amostras de produtos de densidade e dureza variadas e, em todos os casos, uma recuperação de pesticida significativamente maior foi obtida para amostras preparadas usando o Geno / Moedor do que para amostras agitadas manualmente.
Além disso, como o tempo de execução e a taxa de operação são controlados automaticamente pelo Geno / Moedor, todas as amostras dentro de uma corrida e de uma corrida para outra são agitadas de maneira consistente, eliminando a variabilidade. O Geno / Grinder também pode agitar até dezesseis tubos de centrífuga de 50 ml em uma operação, aumentando assim o rendimento da amostra. Isso não apenas reduz o tempo gasto na preparação da amostra, mas também reduz a fadiga dos trabalhadores do laboratório.
Finalmente, as amostras do produto podem ser moídas em tubos de centrífuga de 50 ml usando o Geno / Grinder, possivelmente eliminando a necessidade de pré-homogeneizar o produto. Frutas moles, como morangos, podem ser moídas na presença dos sais e do solvente de extração usados ​​no método QuEChERS sem impacto negativo na recuperação de pesticidas.