Extração rápida de DNA de semente de arroz (úmida)

Extrações de DNA podem ser um processo demorado e tedioso. É essencial encontrar um método rápido no qual o DNA possa ser extraído e usado para PCR. Descrito abaixo está um método rápido “sujo” que produz uma concentração suficientemente alta de DNA que pode ser usada para PCR.

Três matrizes de frutas e vegetais foram escolhidas com o objetivo de avaliar materiais com diferentes densidades e tenacidade: 1) morango – macio; 2) maçãs – densas e duras; e 3) aipo – fibroso. Os morangos são muito macios e testes preliminares verificaram que eles poderiam ser facilmente moídos até uma substância mole e liquefeita usando o Geno / Moedor (método de moagem descrito abaixo). As maçãs são mais duras e densas e, não surpreendentemente, um tempo de moagem mais longo foi necessário para triturar efetivamente a fruta até a consistência de compota de maçã. Embora o aipo não seja tão denso quanto a maçã, ele é fibroso e duro e, portanto, difícil de moer com eficácia.

As amostras são preparadas usando um bloco de ensaio de 1 ml de 96 poços. Dispense uma esfera de aço inoxidável de 5/32 ”(4 mm) em cada poço usando o dispensador de esferas de moagem (SPEX SamplePrep cat. # 2100). Em seguida, adicione uma semente a cada poço. Dispensar tampão de extração em cada poço e tampar cada poço com segurança. Depois que as amostras foram fechadas, triture-as no Geno / Moedor a 500 golpes / minuto por dois minutos. Centrifugue por 1 minuto para trazer todo o líquido para o fundo do bloco de ensaio. Incube as amostras em cerca de 1 polegada (25 mm) de água a 95 ° C por 20 minutos e coloque-as no gelo por aproximadamente 10 minutos ou até que as amostras estejam frias ao toque. Centrifugue novamente por 1 minuto. Adicionar tampão de extração neutralizante e selar o bloco de ensaio com filme de vedação. Centrifugue as amostras por 10 minutos a 3000 rpm. Transfira 300 µL do sobrenadante para uma placa de 96 poços limpa.

Rendimentos
As concentrações totais obtidas a partir das amostras variam de 3-7ng / µL em um volume final de 200 µL com purezas de 1,5-1,8 ng / µL.

O método descrito acima é suficiente para PCR e leva menos tempo do que a extração padrão com clorofórmio. O tempo total varia de uma a duas horas.